缺氧探針檢測試劑盒說明書

缺氧探針檢測試劑盒

Hypoxyprobe, Inc.（缺氧探針公司）是一家致力于為氧代謝紊亂引起的惡性和正常組織疾病提供診斷和治療工具的小公司。公司位于美國馬塞諸薩州伯靈頓（121 Middlesex Turnpike, Burlington, Massachusetts, USA 01803），屬于美國國際天然藥物公司（Natural Pharmacia International, Inc.，NPI）缺氧探針部門的衍生公司。 Hypoxyprobe, Inc.（缺氧探針公司）的成立起源于James Raleigh教授（任職于查珀爾希爾（Chapel Hill）北卡羅萊納大學放射腫瘤學部門）和NPI（當時位于北卡羅萊納Research Triangle Park）之間的合作。起初的合作著重于腫瘤缺氧的臨床研究。NPI大規模生產缺氧探針Pimonidazole HCl，而James Raleigh教授保護的抗體，特異性檢測人腫瘤上結合Pimonidazole的缺氧細胞。總體來說，使用Pimonidazole HCl作為缺氧標記物，用在狗、大小鼠上的臨床前研究越來越受科研圈的關注。2002年NPI授權五年給Chemicon公司銷售缺氧探針試劑用于動物研究。2006年預測到市場對缺氧探針試劑的擴張需求，NPI終止chemicon授權并成立Hypoxyprobe, Inc.（缺氧探針公司）以開發更優秀且更寬廣的試劑用于動物和臨床研究。如今的Hypoxyprobe, Inc.（缺氧探針公司）專注于研發非侵略性的缺氧標志物（Hypoxia maker）和缺氧依賴性的細胞因子，所有產品皆基于Pimonidazole核心結構來開發。

特色產品：

HypoxyprobeTM-1 Plus Kit 缺氧探針檢測試劑盒

關鍵詞：

Hypoxyprobe, Inc.（缺氧探針公司）；Pimonidazole HCl；缺氧標志物，（Hypoxia maker）；Chemicon Inc，派諾硝唑，低氧探針，缺氧探針，乏氧探針

產品應用：

免疫化學法檢測細胞和組織缺氧情況，包括免疫熒光（IF），免疫組化（IHC），WB或流式細胞分析（FC）。

試劑盒組分：

試劑盒組分詳細描述：

1、Hypoxyprobe-1

Hypoxyprobe-1是2-硝基咪唑的替代物，其化學名和成分是Pimonidazole hydrochloride（Pimonidazole HCl，派諾硝唑），分子量為290.8，水溶性為400mM（=116 mg/ml），紫外吸收（324nm）的吸光系數為7020（0.9%生理鹽水）。

Hypoxyprobe-1的粉末和溶液形式皆具化學穩定性。比如，固體形式的Hypoxyprobe-1于柔弱光線下室溫保存2年，UV和HPLC分析法評估無任何降解發生。溶于0.9%生理鹽水的Hypoxyprobe-1，濃度100g/L置于2-8℃保存4.5年，UV和HPLC分析法評估無任何降解發生。

2、FITC-MAb1抗體

FITC-MAb1是FITC偶聯的抗派諾硝唑探針的小鼠IgG1單克隆抗體（克隆4.3.11.3），濃度為0.5mg/ml（in PBS）。可用免疫組化檢測（IHC），冰凍切片或者福爾馬林固定的石蠟包埋切片；也可組織降解后用流式分析法檢測；

3、Anti-FITC HRP抗體

本抗體為偶聯HRP的兔抗FITC IgG多克隆抗體。用于檢測福爾馬林石蠟包埋的小鼠腫瘤組織，不僅有強熒光信號，且背景極其低。

檢測原理：

低氧標志物測定(hypoxia markers)是利用還原硝基有選擇性結合乏氧細胞的能力而形成的一種從細胞水平測定腫瘤乏氧的技術，其原理是：腫瘤乏氧細胞還原能力強，當具有電子親合力的硝基咪唑主動擴散透過細胞脂膜，在細胞內硝基還原酶作用下，硝基被還原，還原產物與大分子物質不可逆結合，滯留在組織內。而正常含氧細胞親電子硝基咪唑還原產物立即被氧化，從而用硝基咪唑類化合物在腫瘤內的代謝程度來反映腫瘤的乏氧。

Pimonidazole是新型的乏氧細胞標記物，HPI公司擁有硝基咪唑類化合物特異性抗體，該抗體為公司技術，在此基礎上公司開發了不同標記的特異性抗體，方便可用：利用免疫組織化學，酶聯免疫吸附試驗和流式細胞儀技術分析對腫瘤細胞分析檢測

使用指南：

1、 Animal Studies 動物研究

研究正常或腫瘤組織缺氧首先通過靜脈注射（intravenous infusion）、腹腔注射（intraperitoneal injection）或口服（oral ingestion）法給Hypoxyprobe-1溶液，劑量為60mg/kg體重。比如，25g小鼠的探針用量為1.5mg/只小鼠。（高達400mg/kg的劑量用于小鼠無可見毒性或引起組織缺氧變化，但60mg/kg以成本給予良好的染色結果）。

給藥后，Hypoxyprobe-1分布到包括大腦的所有組織，且僅僅在氧濃度≤14μM（相當于pO2=10mm Hg，37℃）的細胞內與蛋白質巰基形成加合物。除了腫瘤之外，正常組織如肝臟、腎臟和皮膚含pO2等于或低于10mm Hg的細胞，也會結合Hypoxyprobe-1。

2、Tissue cultures 組織培養

通常情況下，細胞懸液置于含100-200μM Hypoxyprobe-1的缺氧環境中孵育1-2h。之后細胞離心涂片、固定、FTIC-MAb1和anti-FITC chromogenic secondary染色。

常見問題解答（FAO）：

※Hypoxyprobe-1 探針如何溶解？

Pimonidazole HCl 是弱堿性鹽酸鹽，水溶性非常好，建議溶解于116mg/ml 的中性生理鹽水。

※Pimonidazole HCl免疫劑量是多少？

對于常規的小動物大小比較均一的，例如：小鼠或大鼠，我們推薦：探針用量：60 mg/kg。從30 mg/kg 到 400 mg/kg在小鼠和大鼠都有用到，在此范圍內的探針用量，不會由于血流效應而導致毒性或氧量的改變。對于體型較大個體，注射劑量依據個體的基礎表面積而定。對于人樣本，推薦劑量為：0.5 mg/m2，狗樣本：0.28 mg/m2

※  Pimonidazole HCl 探針是否能夠滲透進入低氧大腦組織或腦腫瘤組織？

 Pimonidazole HCl可以自由滲透進入腦和腦腫瘤組織。

※探針注射后，多久可以進行收獲組織？

 對于人體組織的一些研究表明，收獲組織需要在免疫后15-24小時后檢查。探針在血漿中的半衰期是5小時，因此16-24小時相當于3-5個探針半衰期循環。也就是說：在組織檢查時：大概有1/8 到1/32 的探針仍存在，冷固定后，這樣減少了非特異性染色，且低背景。

另外關于人類腫瘤研究表明，活組織檢查應該在免疫后，1.5-4小時，然后組織及時轉到液氮固定。這種方法背景也較低。小鼠血漿中的探針半衰期在0.25小時。這種情況下，采取1-2小時收獲組織然后采取快速固定方法，可有效的消除背景。