淋巴組織細胞或培養細胞表面抗原流式檢測步驟

淋巴組織細胞或培養細胞表面抗原流式檢測步驟 
（一）細胞樣品準備 
收集組織或細胞 
1. 取出目的組織（如:脾臟、淋巴結、胸腺、骨髓等），迅速浸泡在 Cell Staining Buffer 
(BioLegend Cat. #420201)中，并應用研磨及過濾等方法制備成單細胞懸液；如果為體外
培養細胞，直接用 Cell Staining Buffer 重懸細胞后進行下一步操作。 
2. 添加 Cell Staining Buffer 至約15mL，離心（350 x g）5分鐘后棄去上清液。 
裂解紅細胞（脾臟組織等） 
3. 如樣品為脾臟組織細胞，需要裂解紅細胞。把10X 紅細胞裂解液(RBC Lysis Buffer ) 
(BioLegend Cat. #420301)  用去離子水稀釋成 1X工作液。然后用3 ml 紅細胞裂解工作
液重懸細胞后，在冰上孵育 5分鐘。 
4. 加入 10 ml Cell Staining Buffer 到管中；離心（350 x g）5分鐘后棄去上清液。 
5. 重復洗滌細胞一次（步驟2）。 
6. 用 Cell Staining Buffer 重懸細胞后計數，稀釋細胞為 5-10 x 106 細胞/ml，然后每支流
式檢測管中加入100uL細胞懸液（5-10 x 105 細胞/管）。 
Fc受體封閉（可選） 
7. Fc受體的封閉過程是為了減少抗體的非特異性結合造成的影響；對于小鼠細胞的檢測，
BioLegend 公司的純化抗小鼠  CD16/CD32 抗體特異識別并結合 Fcγ R III/II (Cat. 
#101302, clone 93)，適用于封閉抗體非特異染色；實驗操作為用 5-10 μg/ml 純化CD16/32
抗體與細胞冰上孵育 10分鐘。而對于市面上沒有可用的人或大鼠封閉抗體，可以采用
加入無關純化免疫球蛋白（如與所用熒光標記抗體相同種屬和抗體亞型）到細胞樣品中
進行封閉。 
（二）細胞表面熒光染色步驟 
8. 在每個流式檢測管中加入適量的預稀釋好的一抗（熒光標記抗體、生物標記抗體或純
化抗體）；在空白管/孔或同型對照管/孔中加入與抗體相同量的對照試劑。然后各管避
光冰浴或在4℃冰箱中孵育 15-20分鐘。（注：有些抗體可能需要更長的孵育時間，建
議實驗者進行預試驗摸索） 
9. 加入至少 2mL Cell Staining Buffer，然后 350g離心5分鐘后棄去上清液；重復洗滌過
程兩次。 
10.（間接標記）若使用的一抗是純化或生物素標記抗體，則每管/孔加入適量稀釋好的
熒光標記二抗或熒光標記親和素（SAv-PE, BioLegend Cat. # 405204）后于冰浴或在4℃
冰箱中避光孵育15-20 分鐘。 
11. 重復洗滌細胞一次（按步驟 9）。 
12. 用 0.5 ml Cell Staining Buffer  重懸細胞；如有必要，加入 10uL(0.25 μg)/million 細胞
的核染料7-AAD(BioLegend Cat. #420401)以區分活、死細胞，冰上孵育3-5 分鐘。（注：
我們不建議7-AAD與 PE-Cy5  或  PE-Cy7 等熒光標記抗體聯用）13.上機檢測并分析結
果。 
B．全血細胞表面抗原的流式檢測步驟 
1.往含有100uL 抗凝全血的流式檢測管中加入適量的預稀釋好的一抗（熒光標記抗體、
生物標記抗體或純化抗體）。 
2. 室溫避光孵育15-20分鐘。（注：有些結合能力較低的抗體可能需要更長的孵育時間，
建議實驗者進行預試驗摸索） 
3.把10X  紅細胞裂解液(RBC Lysis Buffer ) (BioLegend Cat. #420301)  用去離子水稀釋
成1X工作液，用之前恢復至室溫。加入2 ml  紅細胞裂解工作液到含全血/一抗的檢測 
 
管中，室溫孵育10分鐘。 
4.350g離心 5分鐘后棄去上清液。 
5.加入至少2mL Cell Staining Buffer，然后 350g離心5分鐘后棄去上清液。 
6.（間接標記）若使用的一抗是純化或生物素標記抗體，則每管/孔加入適量稀釋好的熒
光標記二抗或熒光標記親和素（SAv-PE, BioLegend Cat. # 405204）后室溫避光孵育15-20
分鐘。 
7.重復洗滌細胞一次（按步驟 5）。 
8.用500ul Staining Buffer 或 500ul 2%的多聚甲醛固定液重懸細胞。 
9.上機檢測并分析結果。