流式細胞儀檢測方法

一、測定用乙醇固定的DNA的含量

1、培養細胞的DNA含量的測定

制備單細胞懸液于200μl的PBS緩沖液中；

加入2ml預冷的70%乙醇，4℃保存；

附:細胞固定的一般步驟

1) 取單細胞懸液1～2×10⁶個細胞于PBS（PH=7.2）緩沖液中；

2) 300g離心5分鐘，棄上清，反復兩次；

3) 重懸細胞于0.5ml PBS緩沖液中；

4) 將細胞懸液放置于2～3ml冷70%乙醇中，混勻，保存于4℃，至少30分鐘。在4℃條件下可保存2~3周。

注意：

² 根據實驗的要求，固定劑也可選用1～3%多聚甲醛；

² 將乙醇作為固定劑時，乙醇應預冷至0～4℃；

² 細胞在固定時，固定劑應緩慢滴入細胞懸液中，使固定劑的濃度緩慢增加，并不斷震搖，以免細胞成團（特別是用乙醇固定時）。

² 300g離心5分鐘，去上清，再重懸于400μl PBS中；

² 顯微鏡下觀察，若有明顯的黏附，須再用篩網過濾；

² 加入PI（含Rnase），避光孵育30分鐘；

² 上機檢測。

2、新鮮組織的DNA含量的測定

1) 用200mg濕重組織用機械法制成單細胞懸液；

2) 500g離心5分鐘；

3) 棄上清，重懸于10ml染色-去污劑中；

4) 再過濾，用200目的篩網或70~80μm的篩網過濾；

5) 上機檢測。

3、石蠟包埋組織切片的DNA含量的測定

1) 從石蠟包埋切取切片50 μm厚，2~3片，制成單細胞懸液；

2) 用PBS緩沖液洗滌，500g離心5分鐘，棄上清；

3) 加入PI液1ml室溫避光30分鐘；

4) 調整細胞濃度為1×10⁶/ml；

5) 上機檢測。

二、細胞凋亡檢測及相關分子檢測

1、細胞DNA含量分布（由細胞DNA降解方式檢測細胞凋亡）

² 收集已固定的單細胞懸液約5×10⁵~1×10⁶/ml；

² 離心除去固定液，3ml PBS重懸細胞;

² 1500rpm離心，5分鐘 ，棄去PBS；

² 加PI染液1ml，室溫避光20分鐘；

² 調整細胞濃度5×10⁵/ml；

² 上機檢測。

2、磷脂酰絲氨酸外翻分析檢測細胞凋亡

1) 常規制備單細胞懸液,用PBS洗兩次.(若為全血要先溶 血),取約5×10⁶個細胞，1500rpm離心,棄上清,用400μl 1×Binding Buffer重懸；

2) 分成a、b、c、d、e五管，每管約1×10⁶個細胞

a) 陰性對照，不加任何試劑；

b) 陽性對照,加2%多聚甲醛固定30分鐘,加AnnexinV 5μl,室溫10min,用1×Binding Buffer洗一次,棄上清再加190μl 緩沖液、10μl PI避光15分鐘

c) 加10μl PI，避光孵育15分鐘；

d) 加5μl AnnexinV液，室溫避光孵育15min；

e) 加10μl PI和5μl AnnexinV液，室溫避光孵育5min；

3) 每管各加400μl 1×Binding Buffer。

4) 上機檢測。

注意 a. 操作動作要盡量輕柔，勿用力吹打細胞；

b. 操作時注意避光；

c. 反應完畢后盡快檢測，在一小時內檢測。

3、用單克隆抗體APO2.7檢測細胞凋亡

1) 放置0.5~1×10⁶個細胞到試管中；

2) 室溫離心200g，6min；

3) 棄上清，加入100μl冷的（4℃）在PBSF溶液中含100µg/ml的digitonnin，輕輕地重懸細胞，在冰上孵育20min；

4) 加入2ml冷的（4℃）PBSF液，室溫離心200g，6min；

5) 棄上清，加入20μl PE標記的Apo2.7 單克隆抗體和80μl PBSF液，用vortex輕輕震蕩，室溫避光孵育15分鐘；

6) 加入2ml PBSF液，室溫離心200g，6min；

7) 棄上清，加入1ml PBSF液重懸細胞；

8) 避光保存，直到流式細胞儀檢測。

PBSF：含2.5% FCS（v/v）和0.01%NaN3（w/v）的PBS。

三、用流式細胞術進行DNA周期分析

1、方法：同DNA含量檢測

2、注意：

單細胞濃度應約10⁶/ml，以免影響檢測的CV值和檢測結果；

制備完成后的標本應用光學顯微鏡檢查其質量（如細胞是否聚集或過多碎片），以保證得到足夠的細胞含量；

醛類固定會影響PI與核酸的結合。

四、免疫熒光標記法

1、細胞膜上的免疫熒光檢測法

間接標記法

1) 制備單細胞懸液；

2) 細胞計數，取出1×10⁶個細胞于試管中；

3) 用臺盼藍染色計活細胞數，要求活細胞數 >90～95%；

4) 在試管中加入一抗，（劑量按照說明書的要求），孵育30～60分鐘；

5) PBS洗滌1～2次，1500rpm，離心3分鐘，棄上清；

6) 加入二抗，孵育20～30分鐘；

7) PBS洗一次，1500rpm，離心3分鐘，棄上清;

8) 加300μl PBS，上機檢測(若不能及時上機檢測，可加1ml 1%多聚甲醛固定，可放置1周)。

直接標記法

①～③同間接標記法

④在試管中加入熒光標記的抗體，混勻，孵育30分鐘；

⑤用PBS洗2次，1500rpm，離心3分鐘，棄上清;

⑥加300μl PBS(PH=7.4)，上機檢測。

2、 細胞膜內的免疫熒光標記法

間接免疫熒光標記法

1) 取已制備好的單細胞懸液，用1～3%的多聚甲醛固定30分鐘（也可4℃保存Overnight）；

2) 用PBS洗兩次，棄上清；

3) 細胞膜打孔，加入0.1%皂素 200μl，室溫10分鐘；

4) 用PBS洗滌兩次；

5) 加入*抗體，室溫30～60分鐘，或4℃Overnight，同時須設陰性對照或同型對照管；

6) 用PBS洗滌兩次；

7) 加入二抗（熒光標記的抗體）室溫20分鐘，避光；

8) 用PBS洗滌1～2次，棄上清；

9) 重懸細胞于500μlPBS中，上機檢測。

直接熒光標記法

①～⑤同間接熒光標記法；

加入熒光素標記好的抗體，避光30分鐘（同時做同型對照管）；

用PBS洗滌１～２次，棄上清；

加300μl PBS上機檢測。

細胞膜上及細胞內雙標記法（直標法）

1) 取出已制備好的未固定的單細胞懸液1×10 ⁶個細胞于試管中；

2) 用PBS洗滌兩次；

3) 加入用熒光素標記的抗體來標記細胞膜上的抗原，同時加上陰性對照管，室溫孵育20分鐘；

4) 在試管中加入1％～3％多聚甲醛1ml，固定30分鐘；

5) PBS洗滌兩次1500rpm 3分鐘，棄上清;

6) 打孔，加入0.1％皂素200μl室溫10分鐘;

7) 用PBS洗滌兩次，棄上清;

8) 加入用熒光素標記的抗體，標記膜內的抗原（標記膜內的抗體的熒光素的顏色與膜上標記的熒光素的顏色務必不相同）室溫20分鐘孵育;

9) 用PBS洗一遍棄上清；

10) 用300μlPBS重懸細胞，上機檢測

五、流式細胞術中的幾點注意事項：

1、對照組的設置：

在流式細胞術中所測得的量都是相對值，不是值。如需知道值時必須設置對照組樣品。對照組樣品包括有陰性對照和陽性對照。

（1）、陰性對照的設置

² 在實驗過程中，如做間接標記法，可設置與一抗無關的實驗，即在實驗中不加一抗而只加上帶有熒光標記的第二抗體作為陰性對照管，作為陰性對照。

² 在實驗過程中，假設做直接標記法，可設置理論上的陰性細胞作為陰性對照管，實驗過程及步驟與實驗組務必相同。（做間接標記法時，同樣也可同時設置“陰性細胞”的陰性對照管作為陰性對照。

² 在實驗過程中，假設做直接標記法，可將實驗組細胞，取一管，加上與實驗抗體所標記的熒光顏色相同的同型對照來作為陰性對照。

（2）、陽性對照的設置：

在實驗過程中如涉及到表達缺失或減少的實驗，應設置陽性對照組，其設置方法與陰性對照設置相同。

2、幾點建議：

1) 在實驗過程中，在保證實驗的科學性和準確性的基礎上，應盡量減少實驗工序和過程。由于間接標記法的工序多，實驗過程長，如再加之操作的不熟練，細胞更容易丟失和受損，而造成實驗結果的誤差。因此，在條件允許的范圍內，建議盡量做直接標記法而不去做間接標記法，以保證實驗的真實性和準確性。

2) 建議送檢細胞一定要足夠量，一般要求1×10⁶個細胞。不要過少。因為，如細胞太少檢測時樣本流量相對會增大從而影響變異系數，結果也不可信。細胞量也不宜過多，因細胞量太多加入的抗體或染料相對不足，結果也由此受影響。

3) 同一種細胞需同時做雙標記時，須做雙標記的同型對照，且兩種抗體所標記的熒光顏色務必不同。