流式細胞術(shù)常見問題及其解答

BioLegend公司提供了哪些熒光標(biāo)記抗體？
答：BioLegend公司提供APC、APC/Cy7、Alexa FluorTM 488、Alexa FluorTM 647、Alexa FluorTM 700、Biotin、Brilliant VioletTM 421、FITC、DyLightTM 594、DyLightTM 649、Pacific BlueTM、PE、PE/Cy5、PE/Cy7、PerCP、PerCP/Cy5.5共計16種熒光素標(biāo)記的7000多種流式抗體供客戶選擇。

流式細胞實驗的對照應(yīng)該如何設(shè)置？什么是同型對照？
答：①在應(yīng)用流式技術(shù)檢測細胞表面抗原時，我們通常要設(shè)的一個對照就是同型對照。
同型對照：使用與熒光標(biāo)記抗體相同來源、相同標(biāo)記、相同劑量和亞型的免疫球蛋白，用于消除由于抗體非特異性結(jié)合到細胞表面而產(chǎn)生的背景染色。
②細胞因子的流式檢測時，由于細胞經(jīng)過了培養(yǎng)刺激活化的處理，為保證測得結(jié)果的準(zhǔn)確性和客觀性，除了同型對照外，還需另設(shè)置未刺激對照和刺激對照。
未刺激對照：激活時由于BFA等的存在抑制了胞內(nèi)蛋白的轉(zhuǎn)運，因此在激活過程中產(chǎn)生的抗原與細胞因子會滯留胞內(nèi)，未刺激對照也應(yīng)包含BFA等阻斷劑。
激活對照：激活對照使用細胞表面表達CD69來評價激活與否，如果未達到CD69期望的水平，則激活步驟出了問題，某一試劑可能失活，過期，制備不當(dāng)或溶劑污染，需制備新鮮刺激劑重新實驗。

間接免疫熒光標(biāo)記法如何設(shè)置同型對照？
答：同型對照的目的是消除由于抗體非特異性結(jié)合到細胞表面而產(chǎn)生的背景染色，而確保檢測結(jié)果的真實性。在采用間接免疫熒光標(biāo)記法流式檢測時，所設(shè)的同型對照是與一抗相同劑量、相同亞型和相同生物素標(biāo)記（或純化）免疫球蛋白，之后的熒光標(biāo)記過程與實驗檢測組相同即可。BioLegend公司提供了各色標(biāo)記和純化的同型對照免疫球蛋白。

為什么流式細胞術(shù)多色分析時要進行熒光補償調(diào)整？
答：在進行流式細胞術(shù)多色分析時,待測細胞通常攜帶兩種或兩種以上的熒光素,如異硫氰熒光素（FITC）、藻紅蛋白（PE）、別藻紅蛋白（PECY5）等。這些熒光素被激光激發(fā)后發(fā)出不同波長的熒光,理論上每一種熒光通過選擇恰當(dāng)?shù)臑V光片可被相應(yīng)的檢測器檢測到,而不受其他熒光的干擾。但目前這些熒光染料都具有寬發(fā)射譜性質(zhì),盡管它們的發(fā)射峰各不相同,但發(fā)射譜范圍有一定的重疊,也就是說,相鄰的檢測器會檢測到彼此的熒光信號,例如,FITC檢測器會檢測到少量的PE光譜,而PE檢測器會檢測到較多的FITC光譜。這樣就影響了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性,因此,多色分析時必須進行光譜重疊的校正。

如何檢測胞內(nèi)因子抗體的特異性？
答：可以應(yīng)用過量的相應(yīng)細胞因子先封閉該胞內(nèi)因子的熒光標(biāo)記抗體，或者先用不帶熒光標(biāo)記的相應(yīng)因子抗體先封閉細胞，進一步流式操作作對照；另外同型對照也可以判斷細胞的固定、破膜的效果以及非特異性背景的影響。

為什么用CD45αSSC設(shè)門法進行流式細胞術(shù)白血病表型分析？
答:免疫分型所用的樣本通常是骨髓,由于骨髓中各種大小和分化程度的細胞均有,只根據(jù)細胞大小和顆粒密度很難將不同組分的細胞區(qū)分開。而造血系統(tǒng)細胞的CD45表達的熒光強度（FI）與細胞分化程度有一定關(guān)系,即分化程度高的成熟白細胞其CD45的FI也高,分化程度低的細胞其FI也低,而紅系細胞的FIzui低。在成熟白細胞中,各類細胞其CD45的FI亦不相同,其中淋巴細胞和單核細胞的FI高于中性粒細胞。因此,根據(jù)各類細胞CD45的FI和顆粒密度不同,采用CD452SSC（側(cè)向角散射）設(shè)門法可以將原始細胞（低FI,低或高SSC）、淋巴細胞（高FI,低SSC）、單核細胞（高FI,中等SSC）、中性粒細胞（低FI,高SSC）、紅系細胞（zui低FI,低或高SSC）和細胞碎片（zui低FI,zui低SSC）清楚地區(qū)分開。