流式細胞儀標本的制備

流式細胞儀（FCM）是八十年代集單克隆抗體、熒光化學、激光、計算機等高技術發展起來的一種先進儀器，已廣泛應用于免疫學、生物化學、生物學、腫瘤學以及血液學等方面的研究和臨床常規工作。其中檢測人白細胞表面標志可對白血病、淋巴瘤作用迅速正確的診斷，對淋巴細胞群和亞群進行分類，還能分離純化某一群或亞群細胞。活細胞免疫熒光技術是用于FCM檢測的標本準備，染色后也能在熒光顯微鏡下進行觀察，在某些實驗條件下，活細胞免疫熒光染色后的特異性和敏感性要優于滴片固定的常規間接免疫熒光的
結果。
　　（一）　原理
　　活細胞表面保留有較完整的抗原或受體，先用特異性鼠源性單克隆抗體與細胞表面相應抗原結合，再用熒光標記的第二抗體結合，根據所測定的熒光強度和陽性百分率即可知相應抗原的密度和分布。
　　（二）　操作步驟
　　　　　制備活性高的細胞懸液（培養細胞系、外周血單個核細胞、
　　　　　胸腺細胞、脾細胞等均可用于本法）
　　　　　　　　　　　　　　　　　↓
　　　　　　　　　用10％FCS　RPMI1640調整細胞濃度為
　　　　　　　　　5×10６～１×10７／ml
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　　　　　　　　取40μl細胞懸液加入預先有特異性McAb（5～50μl）
　　　　　　　　的小玻璃管或塑料離心管，再加50μl 1∶20（用DPBS
　　　　　　　　稀釋）滅活正常兔血清
　　　　　　　　　　　　　　　　　↓4℃ 30min
　　　　　　　　用洗滌液洗滌2次，每次加洗滌液2ml左右
　　　　　　　　　　　　　　1000rpm×5min
　　　　　　　　　　　　　　　　　↓
　　　　　　　　　棄上清，加入50μl工作濃度的羊抗鼠
　　　　　　　　　（或兔抗鼠）熒光標記物，充分振搖
　　　　　　　　　　　　　　　　　↓　4℃ 30min
　　　　　　　　　用洗滌液洗滌2次，每次加液2ml左右
　　　　　　　　　　　　　　1000rpm×5min
　　　　　　　　　　　　　　　　　↓
　　　　　　　　　加適量固定液（如為FCM制備標本，一般加入
　　　　　　　　　1ml固定液，如制片后在熒光顯微鏡下觀察，
　　　　　　　　　視細胞濃度加入100～500μl固定液）
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　　　　　　　　　FCM檢測或制片后熒光顯微鏡下觀察
　　　　　　　　　　（標本在試管中可保存5～7天）

　　（三）　試劑和器材
　　1.　各種特異性單克隆抗體。
　　2.　熒光標記的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗體，滅活正常兔血清。
　　3.　10％ FCS RPMI1640, DPBS、洗滌液、固定液（見附錄）。
　　4.　玻璃管、塑料管、離心機、熒光顯微鏡等。
　　（四）　注意事項
　　1.　整個操作在4℃下進行，洗滌液中加有比常規防腐劑量高10倍的NaN３，上述實驗條件是防止一抗結合細胞膜抗原后發生交聯、脫落。
　　2.　洗滌要充分，以避免游離抗體封閉二抗與細胞膜上一抗相結合，出現假陰性。
　　3.　加適量正常兔血清可封閉某些細胞表面免疫球蛋白Fc受體，降低和防止非特異性染色。
　　4.　細胞活性要好，否則易發生非特異性熒光染色。
　　附:
　　1. DPBS （×10, 貯存液）
　　　　NaCl 80g
　　　　KCl 2g 　　　　　蒸餾水加至1000ml
　　　　Na２HPO４ 11.5g 臨用時用蒸餾水1∶10稀釋
　　　　KH２PO４ 2g
　　2.　洗滌液
　　　　DPBS　　　　　　900ml
　　　　FCS 50ml （終濃度　5％）
　　　　4％NaN３　　　50ml （終濃度0.2％）
　　3.　固定液
　　　　DPBS　　　　1000ml
　　　　葡萄糖　　　　20g （終濃度2％）
　　　　甲　醛　　　　10ml
　　　　NaN３　　　0.2g （終濃度0.02％）